ВВЕДЕНИЕ

Молекулярная клиническая диагностика - наука, выявляющая причины и механизмы инфекционных и соматических заболеваний на молекулярном уровне, который включает в себя определение генов и продуктов их деятельности – протеинов и нуклеиновых кислот.
Как отдельное направление она начала бурно развиваться в начале 70-х годов после фундаментальных открытий в области молекулярной биологии: во-первых, создание моноклональных антител, взаимодействующих только с определёнными эпитопами (антигенными детерминантами); во-вторых, изобретение метода гибридизации на фильтрах (Саузерн-блотт), названного так по фамилии учёного, предложившего данный способ разделения нуклеиновых кислот (НК). И, наконец, ещё одним “критическим'' научным событием стало открытие в 1985 году метода полимеразной цепной реакции (ПЦР). Эти достижения коренным образом изменили содержание всей молекулярной клинической диагностики.

В современной лабораторной диагностике ПЦР занимает особое место. Метод ПЦР поднял клиническую лабораторную диагностику на принципиально иную высоту - уровень определения нуклеиновых кислот (ДНК и РНК), что позволяет провести прямое обнаружение инфекционного агента или генетической мутации в любой биотической или абиотической среде. При этом способом ПЦР, теоретически, может быть обнаружена всего одна искомая молекула НК среди миллионов других молекул НК. В связи с этим возникает один немаловажный вопрос, принципиальный для инфектологии, насколько тождественны понятия - “НК” и “возбудитель”. С точки зрения общей микробиологии это неравнозначные понятия, т.к. возбудитель это сложная биологическая система, включающая в себя НК, цитоплазму, оболочку и продукты жизнедеятельности микроорганизма. Но при этом НК не может обойтись вне этой сложной структуры, как и сам патоген не может существовать без НК. Поэтому с позиции клинической медицины определение НК является эквивалентом обнаружения/не обнаружения возбудителя в объекте исследования.

Разнообразны области применения метода ПЦР: общая и частная биология, ветеринария, фармация, экология - как способ контроля за качеством объектов окружающей среды и продуктов питания, криминалистика (идентификация личности и отцовства). Особенно эффективным оказалось применение метода в клинической медицине.

Цель данного методического пособия ознакомить широкий круг практикующих врачей различных специальностей (клиницистов, лаборантов, судебных и санитарных медиков и т.п.) с принципами и практическими возможностями метода ПЦР для диагностики различных инфекционных, генетических и онкологических заболеваний.

ПРИНЦИП МЕТОДА ПЦР

В основе метода ПЦР лежит уникальное свойство НК (как ДНК, так и РНК) - способность к саморепродукции, которая воспроизводится искусственно in vitro. При этом синтезируются только строго специфические фрагменты НК. В связи с этим, прежде чем проводить ПЦР, необходимо узнать нуклеотидную последовательность искомой НК. После этого синтезируются два коротких ДНК-зонда или праймера, которые комплементарны соответствующим участками НК-мишени. Праймер – самый главный элемент в ПЦР, обеспечивающий запуск и специфичность реакции. Таким образом, тест-система для ПЦР состоит из смеси НК испытуемого образца, праймера, дезоксирубонуклеотидов (набора нуклеотидтрифосфатов) и термостабильной ДНК полимеразы (энзима термофильных бактерий Termus aquaticus). Вышеуказанную реакционную смесь подвергают повторным циклам нагревания/охлаждения для денатурации (при нагревании) НК и гибридизации или отжиге (при охлаждении) праймеров с целью синтеза (с помощью ДНК-полимеразы) новых НК.

Ход ПЦР схематично показан на рис. 1, где представлены три основных этапа собственно амплификации: денатурации, отжига и синтеза (удлинения) НК. Сама полимеразная реакция проходит автоматически в программируемом термостате – термоциклере (амплификаторе), который может нагревать и охлаждать пробирки с реакционной смесью в очень короткое время. Трехступенчатый цикл, в результате которого получаются точные копии идентифицируемого участка матричной НК, повторяется 30-50 раз в соответствии с заданной программой термоциклера.
В первом цикле происходит первое удвоение фрагмента нити НК, ограниченного праймерами, в последующем реакция приобретает каскадный характер (цепная реакция). Это означает, что каждая из нитей служит матрицей для синтеза (полимеризации) нового участка НК, что позволяет увеличивать число копий амплифицируемого фрагмента НК в геометрической прогрессии