акушерство и гинекология, урология, терапия, ендокринология, ультразвуковая диагностика, лабораторная диагностика

Имуноферментний аналіз: принципи і практичні рекомендації по клінічному застосуванню.

ВВЕДЕНИЕ

Метод иммуноферментного анализа (ИФА) основывается на двух принципиальных научных открытиях. Первое заключается в способности энзимов и антител, ковалентно или нековалентно связанных с твердой основой, сохранять свою функциональную активность, т.е. расщеплять субстрат (ферменты) и связывать антигены/антитела; второе базируется на создании комплекса антитело-фермент (Аb-F) в виде конъюгата, сохраняющего свою биологическую активность в растворе. Аb-F-конъюгаты характеризуются высочайшей специфичностью и чувствительностью, достигающей 97-99%. Существует несколько модификаций ИФА: 1. ELISA (enzyme linked immunoadsorbent assay) - метод определения с помощью иммуносорбентов, связанных с ферментами; 2. EIA (enzyme immunoassay) - метод на основе фермент-иммуноопределения; 3. EMIT (enzyme multiplied immunoassay technique) - способ, основанный на связи с ферментами. Первые две модификации (ELISA и EIA) - это методы гетерогенного или твердофазного анализа (тИФА), а третья разновидность (EMIT) является гомогенным ИФА. Метод ИФА незамедлительно нашел свое самое широкое применение в области иммуногистохимии, иммунологии, медицины и ветеринарии. В настоящее время метод тИФА используется для определения широкого класса веществ: гормонов, онкомаркеров, лекарственных препаратов в крови больного (так называемый, мониторинг лекарственных препаратов), наркотиков, бактерий, вирусов и антител против них. Методами ИФА возможно определение иммуноглобулинов (видовая принадлежность, субклассы, специфичность), а также идентификация лимфоцитов (субпопуляций). В настоящее время практическому здравоохранению стал доступен тИФА благодаря своей невысокой стоимости и экологической безопасности, что привело к тому, что данный метод лабораторного исследования перешёл в разряд стандартных, «рутинных» анализов.
Казалось бы, врач получил в свои руки надежный и точный инструмент для безошибочной диагностики и точной оценки эффективности терапии, другими словами – возможность объективизации лечебно-диагностического процесса. Однако, к сожалению, тривиальность толкования (интерпретации) результатов лабораторных исследований не всегда возможна.
Цель данного пособия представить опыт практического использования и правильной интерпретации результатов, полученных методом тИФА.

ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ МЕТОДА тИФА

Определение антител

Рассмотрим принцип определения специфических Ab методом тИФА, суть которого не зависит от биологического субстрата организма, в котором проводят анализ [ 1 ]. На рис. 1а показана общая схема метода, состоящего из трех стадий, соединенных на рисунке знаком плюс. Во время каждой стадии в систему добавляется очередной компонент, инкубируется некоторое время, необходимое для образования иммунного комплекса. Затем ячейка промывается для удаления не связавшихся компонентов. После этого переходят к следующей стадии реакции, которая обозначена следующим знаком плюс на схеме. Рассмотрим подробнее процесс образования иммунного комплекса, который представлен на рис. 1а.
На твердой поверхности пластиковой лунки, изображенной на рисунке слева, сорбирован Ag любого инфекционного агента (фрагмент вируса, бактерии, простейшего и т.п.). В эту лунку вносится исследуемый биологический материал, чаще всего сыворотка крови больного. Если в ней содержатся Ab к инфекционному агенту (на рисунке обведены), то они закрепляются на соответствующих Ag и остаются связанными при промывке. На этом первая стадия заканчивается. Это основная — "специфическая" стадия процесса. Последующие стадии нужны лишь для выявления образовавшегося иммунного комплекса.

На второй стадии анализа в лунку вносят Ab с заранее прикрепленным к ним фермен