акушерство и гинекология, урология, терапия, ендокринология, ультразвуковая диагностика, лабораторная диагностика

Лабораторная диагностика инфекции, которая вызвана вирусом Епштайна-Барра.

Заблоцкая С.Г., Шевченко Н.М., Ольховский И.А.


Вирус Эпштейн-Барра (ВЭБ) был впервые описан в 1964 году Epstein, Achong и Barr при электронной микроскопии культуры лимфобластов полученных у больного лимфомой Беркитта. На основе морфологических признаков данный вирус был классифицирован как герпес вирус 4 типа. Этот вирус относится к подсемейству Gammaherpesvirinae рода Gymphocryptovirus. ВЭБ поражает в основном два типа клеток: эпителий верхних дыхательных путей и пищеварительного тракта, а также В-лимфоциты, которые в результате инфицирования иммортализуются. Соответственно, ВЭБ вызывает такие различные заболевания, как инфекционный мононуклеоз или злокачественная лимфома Беркитта, злокачественная носоглоточная карцинома.

Заболевания, обусловленные ВЭБ, относятся также к СПИД- индикаторным патологиям. Показана этиологическая роль ВЭБ при волосатой лейкоплакии - характерного для СПИДа поражения слизистой оболочки рта. Имеются данные о роли ВЭБ в возникновении энцефалопатии при ВИЧ-инфекции. Обсуждается роль ВЭБ, как лимфопролиферативного вируса, в активации специфических В-лимфоцитов, приводящей к прогрессированию ВИЧ-инфекции, развитию неходжкинской лимфомы и синдрома лимфоаденопатии.

Источником вируса является больной человек или носитель, вирус выделяется со слюной в продромальном периоде, в разгаре заболевания и рековалесценции в срок до 6 месяцев. Вирус во внешней среде стоек, поэтому заражение может осуществляться воздушно-капельным и контактно-бытовыми путями. Показана возможность трансфузионной передачи ВЭБ от доноров с острой фазой первичной инфекции. Предполагается также трансмиссивный путь передачи вируса на основе территориального совпадения «лимфоидного пояса» (эндемичные районы по распространенности лимфомы Беркитта) с зоной распространения некоторых комаров и москитов рода Anophelesu Monsonia. Заболевание малоконтагиозно за счет наличия большого числа иммунокомпетентных лиц.

Инфекция, вызываемая ВЭБ, характеризуется разнообразием клинических проявлений. Инфицирование обычно происходит в детстве или подростковом возрасте. В большинстве случаев первичная инфекция у детей протекает субклинически. Распространенность инфекции, вызываемой ВЭБ, чрезвычайно широка. В развивающихся странах практически все детское население к возрасту 3 лет уже инфицировано. Эпидемиологические исследования в США показали, что у детей до 5 лет инфицированость составляет 50%, а у взрослых 80%. Инфекция передается преимущественно через слюну, но описаны случаи трансфузионного заражения.

В юношеском возрасте инфекция ВЭБ может протекать в форме инфекционного мононуклеоза, характерными клиническими проявлениями которого являются боль в горле, лихорадка, спленомегалия, гепатомегалия и аденопатия. Студенты и военнослужащие являются группами повышенного риска развития инфекционного мононуклеоза.
После первичного заражения ДНК ВЭБ может встраиваться в геном В-лимфоцитов и реплицироваться вместе с ДНК клетки-хозяина, что является причиной латентной инфекции, которая может сопровождать человека на протяжении всей его жизни. Транзиторные иммунодефицитные состояния, характерные для больных, перенесших операции по трансплантации органов, больных злокачественными новообразованиями, беременных женщин и лиц преклонного возраста могут приводить к реактивации латентной инфекции. Персистирование ВЭБ является этиологическим фактором клинического синдрома, получившего название «хроническая ВЭБ инфекция» или «хронический мононуклеоз».

В юношеском возрасте инфекция ВЭБ может протекать в форме инфекционного мононуклеоза, характерными клиническими проявлениями которого являются боль в горле, лихорадка, спленомегалия, гепатомегалия и аденопатия. Студенты и военнослужащие являются группами повышенного риска развития инфекционного мононуклеоза.
После первичного заражения ДНК ВЭБ может встраиваться в геном В-лимфоцитов и реплицироваться вместе с ДНК клетки-хозяина, что является причиной латентной инфекции, которая может сопровождать человека на протяжении всей его жизни. Транзиторные иммунодефицитные состояния, характерные для больных, перенесших операции по трансплантации органов, больных злокачественными новообразованиями, беременных женщин и лиц преклонного возраста могут приводить к реактивации латентной инфекции. Персистирование ВЭБ является этиологическим фактором клинического синдрома, получившего название «хроническая ВЭБ инфекция» или «хронический мононуклеоз».

В-лимфоциты, морфологически идентичные таковым у больных инфекционным мононуклеозом, описаны недавно у больных СПИД. Это может быть связано с реактивацией предшествующей ВЭБ инфекции на фоне приобретенного иммунодефицита

В лабораторной диагностике используют серологические методы и методы выявления вирусных антигенов и вирусной ДНК. Вирусный нуклеокапсид выявляют в смывах из носоглотки в реакции иммунофлюорисценции с использованием специфических к ВЭБ антител. Более чувствительным и специфичным является метод детекции ДНК ВЭБ в полимеразной цепной реакции (ПЦР), позволяющей поставить или подтвердить диагноз острой инфекции при выявлении ДНК ВЭБ в слюне и/или крови

Из серологических методов исследования используются различные модификации гетерогемагглютинации для выявления гетерофильных антител. Наиболее распространенной является реакция Пауля-Буннеля, в которой выявляются антитела к эритроцитам барана. (диагностический титр 1:32).

Однако такие антитела могут выявляться и при других заболеваниях (ОРЗ, вирусные гепатиты и др.), что обусловлено наличием в эритроцитах барана F-антигена (антиген Форсмана). Поэтому более специфична реакция Пауля-Буннеля-Давидсона, где сыворотку предварительно истощают субстратом, имеющим F-антиген (например, экстракт почки морской свинки), или реакция Хоффа-Бауэра на лошадинных эритроцитах, не имеющих F-антиген (диагностический титр 1:14 - 1:28). Одна из модификации - реакция Ловрика, проводящаяся на стекле с эритроцитами барана, обработанными и необработанными протеолитическим ферментом папаином. Реакция считается положительной при наличии агглютинации на нативных эритроцитах и при отсутствии таковой на гидролизированных эритроцитах. Основные недостатки методов агглютинации заключаются в их трудоемкости (необходимы свежие эритроциты), недостаточно высокой специфичности и чувствительности, особенно для детей младше 4 лет, для которых ложноотрицательные результаты могут быть получены более, чем в 25% случаях.

Непрямой иммунофлуоресцентный анализ связывания специфических антител с вирусом, культивированным в лимфобластоидных клетках, до сих пор считается «золотым стандартом» серодиагностики ВЭБ - инфекции, однако он не поддается автоматизации и его трудно стандартизировать вследствие вариабельности антиген - продуцирующих клеток и субъективности оценки результатов. В связи с этим в настоящее время все шире в серологической диагностике используется ИФА.

В процессе репликации вируса экспрессируется свыше 70 различных вирусоспецифических белков, однако, к настоящему времени выделены группы наиболее иммуногенных белков, определение антител к которым дает возможность дифференцировать стадию инфекции.

EA (Early Antigen) - ранний антиген, включает белки р54, р138, соответственно диффузный (EA-D) и рестриктрирующий (EA-R) компоненты.
EBNA-1 (Epstein-Barr Nuclear Antigen - ядерный антиген, белок р72
VCA (Viral Capsid Antigen) - капсидный антиген, включает комплекс белков р150, р18, р23; к настоящему времени показано, что иммунодоминантными белками в этом комплексе являются р18 и р23.
MA (Membrane Antigen) - мембранный белок, gh125 (BAKF4).

Наиболее специфичными и чувствительными маркерами острой инфекции являются Ig G к раннему антигену (ЕА) и Ig M к капсидному комплексу (VCA), и паст-инфекции - Ig G к EBNA-1.
Инфицирование клеток-мишеней может вести как к латентному, так и инфекционному циклу развития вируса. В обоих случаях одним из ранних экспрессируемых вирусных агентов является мембранный антиген, распознаваемый Т-лимфоцитами. Установлено, что у большинства пациентов инфицирование ВЭБ приводит к синтезу гетерофильных антител. Экспрессия EBNA-1 антигена происходит через 12-24 часа после заражения, одновременно или после экспрессии мембранного антигена вируса. Показано, что EBNA-1 является неструктурным внутриклеточным антигеном и присутствует во всех трансформированных клеточных линиях, полученных у больных лимфомой Беркитта и назофарингиальной карциномой. В цикле репликации вируса капсидный антиген появляется позже EBNA-1.

Последние исследования указывают на то, что, возможно EBNA-1 является не единичным антигеном, а полиантигеным комплексом. Основной компонент EBNA-1 был очищен и секвенстирован.

Определение антител класса Ig G к EBNA-1 может быть использовано для диагностики острой рековалесцентной стадии инфекционного мононуклеоза. Они редко присутствуют в острой фазе заболевания и их уровень повышается во время выздоровления. Антитела обычно присутствуют в максимальной концентрации в период между 3 месяцами и 1 годом с начала заболевания и персистируют в течении всей жизни.

Ранний антигенный комплекс представляет собой результат ранней транскрипции, предшествующей синтезу ДНК. Матричная РНК, синтезирующаяся в результате транскрипции, кодирует ферменты, необходимые для синтеза вирусной ДНК и дальнейшего образования новых вирусных частиц. Антитела класса IgG к раннему антигену обычно встречаются у больных на ранней стадии инфекции, хотя могут выявляться и на поздних стадиях этого заболевания. Высокий уровень IgG к раннему антигену характерен для больных назофарингиальной карциномой.

Дополнительным подтверждением течения острых стадий инфекции может служить тест по выявлению ДНК ВЭБ в крови и/или слюне методом ПЦР. Этот тест весьма эффективен для выявления ВЭБ - инфекции у новорожденных, когда выявление серологических маркеров малоэффективно вследствие несформировавшейся иммунной системы, а также в сложных и сомнительных случаях.

Таким образом, определение IgG к антигенам EBNA и ЕА, а также IgM к VCA дает необходимую и достаточную информацию для постановки диагноза и установления стадии инфекции.

Таблица 1. Иммунный ответ на разных клинических стадиях инфекционного мононуклеоза

Маркер Острая фаза Острая фаза Рековалесцентная фаза

VCA-Ig G нарастают персистируют на невысоком уровне персистируют пожизненно на невысоком уровне
VCA-Ig M присутствуют снижаются нет или очень мало
EBNA-1 Ig G нет или очень мало начинают нарастать персистируют пожизненно на невысоком уровне
EA-D начинают нарастать персистируют на невысоком уровне персистируют пожизненно на невысоком уровне
гетерофильные антитела присутствуют снижаются нет или очень мало

Таблица 2. Интерпретация серологических данных

    VCA-Ig M EA-IG G EBNA-IG G

1 Инкубационный период или отсутствие инфицирования - - -
2 Очень ранняя первичная инфекция + - -
3 Ранняя первичная инфекция + + -
4 Поздняя первичная инфекция +/- + +/-
(ОП < 0,5)
5 Атипичная первичная инфекция + - _
(ОП < 0,5)
6 Хроническая инфекция -/+ + -
7 Ранняя паст-инфекция - + +
8 Поздняя паст-инфекция - _ +
9 Реактивация + + +
(ОП>0,5)
10 Атипичная реактивация + - +
(ОП>0,5)