акушерство та гінекологія, урологія, терапія, ендокринологія, ультразвукова діагностика, лабораторна діагностика

Полімеразна ланцюгова реакція: принципи і практичні рекомендації по використанню в клінічній практиці лікаря.

ВВЕДЕНИЕ

Молекулярная клиническая диагностика - наука, выявляющая причины и механизмы инфекционных и соматических заболеваний на молекулярном уровне, который включает в себя определение генов и продуктов их деятельности – протеинов и нуклеиновых кислот.
Как отдельное направление она начала бурно развиваться в начале 70-х годов после фундаментальных открытий в области молекулярной биологии: во-первых, создание моноклональных антител, взаимодействующих только с определёнными эпитопами (антигенными детерминантами); во-вторых, изобретение метода гибридизации на фильтрах (Саузерн-блотт), названного так по фамилии учёного, предложившего данный способ разделения нуклеиновых кислот (НК). И, наконец, ещё одним “критическим'' научным событием стало открытие в 1985 году метода полимеразной цепной реакции (ПЦР). Эти достижения коренным образом изменили содержание всей молекулярной клинической диагностики.

В современной лабораторной диагностике ПЦР занимает особое место. Метод ПЦР поднял клиническую лабораторную диагностику на принципиально иную высоту - уровень определения нуклеиновых кислот (ДНК и РНК), что позволяет провести прямое обнаружение инфекционного агента или генетической мутации в любой биотической или абиотической среде. При этом способом ПЦР, теоретически, может быть обнаружена всего одна искомая молекула НК среди миллионов других молекул НК. В связи с этим возникает один немаловажный вопрос, принципиальный для инфектологии, насколько тождественны понятия - “НК” и “возбудитель”. С точки зрения общей микробиологии это неравнозначные понятия, т.к. возбудитель это сложная биологическая система, включающая в себя НК, цитоплазму, оболочку и продукты жизнедеятельности микроорганизма. Но при этом НК не может обойтись вне этой сложной структуры, как и сам патоген не может существовать без НК. Поэтому с позиции клинической медицины определение НК является эквивалентом обнаружения/не обнаружения возбудителя в объекте исследования.

Разнообразны области применения метода ПЦР: общая и частная биология, ветеринария, фармация, экология - как способ контроля за качеством объектов окружающей среды и продуктов питания, криминалистика (идентификация личности и отцовства). Особенно эффективным оказалось применение метода в клинической медицине.

Цель данного методического пособия ознакомить широкий круг практикующих врачей различных специальностей (клиницистов, лаборантов, судебных и санитарных медиков и т.п.) с принципами и практическими возможностями метода ПЦР для диагностики различных инфекционных, генетических и онкологических заболеваний.

ПРИНЦИП МЕТОДА ПЦР

В основе метода ПЦР лежит уникальное свойство НК (как ДНК, так и РНК) - способность к саморепродукции, которая воспроизводится искусственно in vitro. При этом синтезируются только строго специфические фрагменты НК. В связи с этим, прежде чем проводить ПЦР, необходимо узнать нуклеотидную последовательность искомой НК. После этого синтезируются два коротких ДНК-зонда или праймера, которые комплементарны соответствующим участками НК-мишени. Праймер – самый главный элемент в ПЦР, обеспечивающий запуск и специфичность реакции. Таким образом, тест-система для ПЦР состоит из смеси НК испытуемого образца, праймера, дезоксирубонуклеотидов (набора нуклеотидтрифосфатов) и термостабильной ДНК полимеразы (энзима термофильных бактерий Termus aquaticus). Вышеуказанную реакционную смесь подвергают повторным циклам нагревания/охлаждения для денатурации (при нагревании) НК и гибридизации или отжиге (при охлаждении) праймеров с целью синтеза (с помощью ДНК-полимеразы) новых НК.

Ход ПЦР схематично показан на рис. 1, где представлены три основных этапа собственно амплификации: денатурации, отжига и синтеза (удлинения) НК. Сама полимеразная реакция проходит автоматически в программируемом термостате – термоциклере (амплификаторе), который может нагревать и охлаждать пробирки с реакционной смесью в очень короткое время. Трехступенчатый цикл, в результате которого получаются точные копии идентифицируемого участка матричной НК, повторяется 30-50 раз в соответствии с заданной программой термоциклера.
В первом цикле происходит первое удвоение фрагмента нити НК, ограниченного праймерами, в последующем реакция приобретает каскадный характер (цепная реакция). Это означает, что каждая из нитей служит матрицей для синтеза (полимеризации) нового участка НК, что позволяет увеличивать число копий амплифицируемого фрагмента НК в геометрической прогрессии (рис.2). Течение ПЦР аналогично естественной репликации НК, но при этом строго фиксированно искусственно синтезированным праймером.

Рис. 1. ПЦР: Полимеразная Цепная Реакция
(Andy Vierstraete, 2001)

Рис.2. Экспоненциальная амплификация ДНК в ПЦР
(Andy Vierstraete, 2001)

Так, если один цикл продолжается примерно 3 минуты, то менее чем через 2 часа можно получить около миллиарда копий определяемой последовательности НК. Если в растворе не окажется ни одной молекулы НК с участком, комплементарным внесенным праймерам, даже, несмотря на то, что в растворе будет плавать миллион других молекул НК, реакция ПЦР не пройдет. После 25-30 циклов экспоненциального нарастания продуктов реакции происходит выход на плато из-за истощения трифосфатов, праймеров и повреждений полимеразы. Поскольку праймеры физически включаются в концы ампликонов, этим самым детерминируется продукт ПЦР – фрагмент НК. Кроме того, ДНК-полимераза обладает способностью выбраковывать (редактировать) ошибочные некомплементарные нуклеотиды. Этим достигается высокая специфичность результатов исследования.

Продукты ПЦР, или ампликоны, представляющие собой участок синтетической НК, ограниченный праймерами, на конечной стадии ПЦР идентифицируют методом элетрофореза в геле.

ПРЕИМУЩЕСТВА ПЦР КАК МЕТОДА ДИАГНОСТИКИ

Одним из важнейших критериев диагностической эффективности любого лабораторного анализа является показатель «чувствительности». При этом следует различать аналитическую и диагностическую чувствительность. Аналитическая чувствительность, применительно к ПЦР, представляет собой то минимальное количество копий (геномных эквивалентов-г/э) ДНК или РНК в одном миллилитре раствора образца, которое может быть определено данной тест-системой. Большинство коммерческих амплификационных тест-систем позволяет обнаружить в биологической пробе искомую НК если ее концентрация составляет не менее нескольких сот г/э копий в 1 мл образца. Например, аналитическая чувствительность большинства тест-системы для ВИЧ-1 составляет 300-500 копий ДНК в 1 мл образца. Диагностическая чувствительность определяется количеством пациентов с данным заболеванием, дающих истинно положительные результаты при использовании конкретного набора и оценивается в процентах. В этом аспекте имеется общее положение, определяющее клиническую пригодность любых лабораторных способов диагностики или тест-систем - диагностическая чувствительность метода не должна быть ниже 95-98%.

Второй универсальный критерий лабораторной эффективности – «специфичность», определяется процентом здоровых людей, имеющих истинно отрицательные результаты анализа. Метод ПЦР обладает высочайшей специфичностью, которая достигает 99-100%.
Диагностическая чувствительность и специфичность ПЦР сопоставимы, а зачастую и превосходят таковые, обеспечиваемые культуральным методом, которые являются «золотым стандартом» в диагностике инфекционных заболеваний. Если учесть продолжительность процедуры выращивания культуры клеток (от нескольких недель до нескольких месяцев), то преимущество метода ПЦР становится несомненным. Результаты ПЦР-анализа можно получить в течение одного рабочего дня, при этом отобранные для анализа пробы могут храниться (накапливаться) в течение даже нескольких недель при соблюдении соответствующих температурных норм. Проведенная недавно в нескольких зарубежных исследовательских центрах суммированная оценка чувствительности различных методов диагностики показала, что “быстрые” или экспресс-тесты имеют чувствительность 40-60%, ИФА - 50-70%, прямая иммунофлюоресценция (ПИФ) - 55-75%, культуральное исследование - 60-80%, а ПЦР от 90 до 100%.

Как видно ПЦР, по сравнению с другими способами обладает двумя важными преимуществами: высокой чувствительностью и непродолжительностью по времени анализа, т.е. «актуальностью» получения результата исследования врачом и пациентом.

Таким образом, приведенные выше факты позволили отметить следующие преимущества ПЦР перед другими методами клинической лабораторной диагностики:

1. Универсальность
Метод принципиально позволяет обнаруживать любые ДНК и РНК даже в тех случаях, когда другими способами это сделать невозможно.
Вне зависимости от объекта и области применения ПЦР (клиническая медицина, криминалистика, ветеринария, генетика, молекулярная биология) используется стандартный комплект приборов. Это обуславливает универсальность процедуры постановки ПЦР при исследовании любых биологических объектов.

2. Специфичность
Высокая специфичность (100%) метода обусловлена тем, что в исследуемом материале определяется уникальный фрагмент НК (нуклеотидная последовательность), характерный только для данного возбудителя или гена. Таким образом, ПЦР - диагностикумы дают возможность избежать проблем, связанных с перекрестно-реагирующими антигенами.

3. Чувствительность
Возможность проведения не только качественной (наличие), но и количественной (концентрация) оценки содержания НК. В настоящее время реальный порог’ чувствительности коммерческих амплификационных тест-систем позволяет определять несколько сот копий в исследуемом образце.

4. Актуальность ответа (быстрота получения результата)
Высокая технологичность и автоматизация метода позволяет получить результаты исследования в руки врача и пациента в день проведения анализа.

5. Возможность доклинической и ретроспективной диагностики
ПЦР позволяет осуществить определение патогена или дефектного гена в организме ещё до развития заболевания. Например, при инфекциях в инкубационном периоде, т.е. серонегативной фазе или при латентном характере заболевания. Кроме того, возможно проведение ПЦР в архивном (фиксированном) материале или биологических остатках, что важно для идентификации личности или отцовства.


6. Проведение анализа возможно в минимальном объеме пробы (до нескольких микролитров), что крайне важно в неонатологии, судебной медицине, клинической генетике и т.п.

7. Возможность одновременной диагностики нескольких возбудителей заболеваний или аномальных генов в одной пробе без ущерба для чувствительности или специфичности результата.

8. Возможность экспертизы
Полученные результаты ПЦР возможно вносить в компьютерные информационные носители или фотографии для оценки независимыми экспертами.

Несмотря на вышеуказанные достоинства метод ПЦР все же не лишен некоторых недостатков, которые следует учитывать при оценке результатов исследований.

НЕДОСТАТКИ МЕТОДА ПЦР

В настоящее время ПЦР, как диагностический тест, имеет определённые недостатки, которые можно выделить в две группы.
Первая - технологическая, подразумевающая под собой высочайшие требования к оснащению лаборатории, качеству тест-наборов и строжайшее соблюдение регламента исследования во избежание получения ложных результатов. Решение проблемы качества анализов возможно при соответствующей квалификации персонала и обязательной сертификации лаборатории. В связи с этим врачи должны требовать от лаборатории, проводящей исследования методом ПЦР государственный сертификат.
Вторая – клиническая, заключающаяся в неоднозначной прогностической оценке положительного результата ПЦР. Именно этот факт зачастую является необоснованным аргументом практических врачей для сомнения в полученном результате и эффективности метода ПЦР. Поясним на примере. Показано, что только у 40% - 60% лиц с обнаруженной в крови методом ПЦР ДНК цитомегаловируса клинически может развиться заболевание. В данной ситуации при оценке результатов исследования, совершается типичная ошибка, заключающаяся в отождествлении двух принципиально различных понятий – “инфицированность” и “инфекционная болезнь”.

Таким образом, недостатки ПЦР лежат не в сути метода, а в неправильном методическом подходе (алгоритме лабораторной диагностики) при обследовании пациента и неверной клинической интерпретации полученных результатов, на чём мы остановимся ниже.

ОБЩЕКЛИНИЧЕСКОЕ И ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ПЦР

Оценивая результаты любого параклинического исследования, врач обязан помнить главное положение: лабораторный анализ и клинический диагноз это не одно и тоже. Клинический диагноз – это совокупность, квинтэссенция клинических, анамнестических и лабораторных исследований. В связи с этим врач, назначая обследование методом ПЦР должен понимать, какова цель исследования.

Метод ПЦР решает три главных последовательных задачи:
• Позволяет определять наличие или отсутствие патогена (или аномального гена).
• В значительной мере отвечает на вопрос «лечить?» или «не лечить?».
• Позволяет оценить качество терапии путем контроля наличия или отсутствия возбудителя или аномального гена.

В узловом вопросе “проводить – не проводить'' терапию, возникающим при диагностировании инфекционного агента, необходимо осознавать, что хотя результат ПЦР и является главным, но это не единственный аргумент в принятии решения о начале лечения или отказе от него. Так как здесь, мы ещё раз это подчеркиваем, врачу необходимо четко различать понятия состояние инфицированности и диагноз инфекционная болезнь.

ОБЩИЙ МЕТОДИЧЕСКИЙ ПОДХОД К ПРОВЕДЕНИЮ ПЦР

Лабораторные диагностические мероприятия должны строится на основе протокола диагностического обследования (алгоритма).
Программу клинико-лабораторных исследований, вне зависимости от раздела клинической медицины необходимо строить следующим образом.
Первый этап - клинический, включающий сбор жалоб и анамнеза, а также физический осмотр пациента.
Второй этап - проведение рутинных клинических анализов, включающий общий анализ крови, мочи, кала и других исследований исходя из предпосылок, возникших на клиническом этапе.
Третий этап - проведение специализированных исследований, включающий серологический, иммунологический, инструментальный или другие анализы, обоснованные результатами двух предшествующих этапов обследований.
Четвертый этап - молекулярно-генетический, в частности, метод ПЦР.

ДИАГНОСТИКА ЧАСТНОЙ ПАТОЛОГИИ МЕТОДОМ ПЦР

В данном разделе будут рассмотрены только некоторые виды патологии, при которых метод ПЦР является основой диагностики и критерием эффективности лечения, а также имеются доступные, стандартизованные, коммерческие тест-системы.

ВИЧ-ИНФЕКЦИЯ

Этиологическим фактором ВИЧ-инфекции являются вирусы HIV-1 и HIV-2 (от англ. Human Immunodeficiency Viruses) из семейства Retroviridae. Патогенез ВИЧ-инфекции заключен в инфицировании вирусом клеток с фенотипом CD-4, присущий Т-лифоцитам хелперам и некоторым другим клеткам организма человека. Прямое цитопатическое воздействие, оказываемое вирусом иммунодефицита на указанные клетки, в конечном итоге приводит к летальному исходу за счет активации оппортунистических инфекций или развития опухолей.

Лабораторная диагностика ВИЧ-инфекции проводится в трёх направлениях:
1. серологическая диагностика маркеров вируса методами иммуноферментного анализа и иммуноблотинга, заключающаяся в определении в сыворотки крови антигенов и антител против ВИЧ.
2. определение вирусной НК (провирусной-ДНК или РНК) методом ПЦР, как в крови, так и в клетках крови.
3. исследование иммунного статуса (количественная оценка CD-4 лимфоцитов), которая наиболее адекватно осуществляется методом проточной цитофлюориметрии.

Особо необходимо отметить значение ПЦР в диагностике ВИЧ-инфекции у детей первого года жизни. Ранняя диагностика ВИЧ-инфекции у детей этого возраста в принципе невозможна без применения ПЦР. Это обусловлено тем, что ребёнок, родившийся от ВИЧ-инфицированной матери обязательно имеет антитела к вирусу иммунодефицита. Различить материнские и собственные антитела к ВИЧ не представляется возможным. У неинфицированного ребёнка данные антитела элиминируются под влиянием собственной иммунной системой к возрасту 6-9 месяцев, хотя в отдельных случаях могут циркулировать до 18 месяцев жизни, но не более этого срока.
Необходимо отметить, что обследование методом ПЦР имеет смысл только при полном отказе от грудного вскармливания ребёнка ВИЧ-позитивной матерью с момента рождения, т.к. риск заражения довольно высок и составляет около 5%.
Таким образом, ПЦР позволяет проводить дифференциальную диагностику ВИЧ-статуса у детей раннего возраста. Так, если имеет место положительный результат ПЦР на НК вируса иммунодефицита в первые 48 часов жизни, то ВИЧ-инфицирование произошло in utero. Если имеет место отрицательный результат ПЦР в первые 48 часов, но становится положительным в возрасте 7 – 14 дней жизни, то инфицирование произошло intrapartum.
В настоящее время ПЦР позволяет осуществлять не только диагностику, но и мониторинг лечения ВИЧ-инфекции путем определения концентрации РНК в плазме, а также выявления резистентных к химиотерапии штаммов вирусаиммунодефицита. Определение “вирусной нагрузки” в плазме крови является наилучшим прогностическим критерием течения ВИЧ-инфекции и оценки эффективности антиретровирусной терапии.
Таким образом, в настоящее время метод ПЦР является основным лабораторным критерием диагностики, прогноза и оценки эффективности лечения ВИЧ-инфекции.

ВИРУСНЫЕ ГЕПАТИТЫ (ВГ)

Современная таксономия вирусов гепатита человека представлена (табл. 1) семью типами возбудителей: А, В, С, D, Е, G и TTV. Для каждого вида возбудителя разработаны амплификационные тест-системы, но наиболее ценным метод ПЦР оказался в диагностике вирусов гепатита В, С, D, G и TTV. Это обусловлено тем, что именно указанные возбудители больше всего ответственны за летальные, хронические и неопластические исходы вирусных гепатитов у людей. В патогенезе ВГ решающую роль играют свойства вируса и генетически детерминированный характер иммунного ответа на этот возбудитель, поэтому не менее важна оценка иммунитета (определение CD-4, CD-8, CD-56 и других фенотипов, уровня интерферонов). Как указывалось выше наиболее точные оценки иммунного статуса получаются при использовании метода проточной цитофлюориметрии.

Общие характеристики вирусных гепатитов

Заболевание/
возбудитель
Геном вируса Способ передачи Диагностические тесты
Гепатит A/HAV Одноцепочечная РНК, 7500 осн. Энтеральный АлАТ, HAV РНК, HAVAg,
антитела к вирусу
Гепатит B/HBV Двухцепочечная ДНК, 3200 осн. Парентеральный АлАТ, HBV ДНК, HbsAg, HBeAg, антитела к вирусным антигенам
Гепатит C/HCV Одноцепочечная РНК,
9500 осн.
Парентеральный АлАТ, HCV РНК,
антитела к вирусу
Гепатит D/HDV Одноцепочечная РНК, 1700 осн. Парентеральный НDV Ag, HDV РНК,
антитела к вирусу
Гепатит E/НEV Одноцепочечная РНК, 7500 осн. Энтеральный AлАТ, HEV РНК,
антитела к вирусу
Гепатит G/HGV Одноцепочечная РНК, 9500 осн. Парентеральный НGV РНК
Гепатит ТТV Одноцепочечная ДНК Парентеральный TTV ДНК

Примечание: АлАТ – аланинаминотрансфераза.

ВИРУСНЫЙ ГЕПАТИТ В (HBV - от англ. Hepatitis B Virus)

Серологическая диагностика и прогноз HBV-инфекции основаны на выявлении антигенов вируса и антител к нему. Но, как оказалось, в популяции вируса гепатита В встречается достаточно много мутантных штаммов (НВеАg-негативных), которые не улавливаются обычными серологическими тестами. Поэтому метод ПЦР для диагностики HBV-инфекции является крайне важным.
Выявление ДНК HBV в крови имеет важное значение для прогноза острого ВГВ (рис. 3). Установлено, что персистирование ДНК HBV более 8 недель после дебюта заболевания указывает на хронизацию процесса (рис. 4), тогда как элиминация ДНК вируса в течение первых 2 недель болезни коррелирует с полным выздоровлением.

Рис.3. Примерный серологический профиль, характерный для острого вирусного гепатита В
с благоприятным исходом

Рис.4. Примерный серологический профиль, характерный для хронического гепатита В,
вызванного вирусом дикого типа

Особенностью HBV-инфекции является наличие феномена так называемого “здорового” носительства НВsAg. Считается, что “здоровое” носительство НвsAg есть интегративная форма хронической HBV-инфекции. Механизм этого феномена заключен в способности вируса гепатита В встраиваться в геном гепатоцита человека. При этом интеграция ДНК вируса в хромосому гепатоцита происходит не в полном объеме (дискретно), что приводит к синтезу только отдельных антигенов, в частности, НВsAg. Интересно отметить, что интегрированная ДНК вируса выявлялась в биоптатах печени у широкого круга лиц от абсолютно здоровых людей до пациентов с первичной гепатомой. В данной ситуации метод ПЦР позволяет дифференцировать интегративную и репликативную формы HBV-инфекции (табл. 2). Это имеет крайне важное клиническое значение, т.к. при интегративной форме HBV-инфекции человек незаразен для окружающих (отсутствует риск вертикальной передачи вируса от матери к плоду, безопасность для полового партнёра, профессиональная пригодность и т.п.). Кроме того, таким пациентам не показана противовирусная терапия, более того она даже опасна. Вместе с тем, при интегративной форме инфекции резко возрастает вероятность развития гепатомы (в 200 раз выше, чем у лиц без маркеров HBV-инфекции). Таким людям необходимо не менее одного раза в год проходить комплексное клинико-лабораторное и инструментальное обследование, включающее в себя осмотр врача, печеночный комплекс, определение альфа-фетопротеина, ДНК HBV, сонографию печени.
Метод ПЦР имеет еще одно немаловажное клиническое значение – он может выступать в качестве арбитра для определения необходимости старта лечения и контроля эффективности терапии. Быстрое и стойкое исчезновение из крови ДНК НВV является прямым и надёжным тестом успешного исхода противовирусного лечения.


Маркеры вируса В в репликативную и интегративную фазы развития HBV-инфекции

Маркеры НВV Фаза развития НВV-инфекции
репликации интеграции
1.Сывороточные:
НВsАg + +
НвеАg + -
НВ V ДНК + -
Аnti-НВс IgМ + -
Аnti-НВс IgG + +/-
Аnti-НВе - +
2. Тканевые:
НВсАg + -
НВsАg + +
НВV ДНК + -

Таким образом, определение ДНК НВV в плазме крови является важнейшим анализом, который в совокупности с другими лабораторными исследованиями позволяет объективно диагностировать инфекцию, определять характер инфекционного процесса, выступать в качестве критерия в проведении терапии и оценки её эффективности.

ВИРУСНЫЙ ГЕПАТИТ C (HC - от англ. Hepatitis C Virus)

Вирус гепатита С относится к семейству Flaviviridae и. был идентифицирован в 1989 году, как главный этиологический факторпосттрансфузионных гепатитов у людей. С открытием НСV начался процесс кардинального пересмотра этиопатогенеза и лечения хронических аутоиммунных гепатитов и криптогенных циррозов печени. По данным ВОЗ около 3% мирового населения инфицированы НСV. При этом ежегодно в мире регистрируется более одного миллиона новых случаев НСV-инфекции, что соответствует уровню пандемии. Особенностями НСV- инфекции является высокая частота хронизации (от 30% до 95% в зависимости от генотипа вируса), длительное бессимптомное или мимикрирующее под другие болезни течение, возможность трансплацентарной и сексуальной передачи инфекции (рис.5).

Рис.5. Фазы течения НСV-инфекции

Рис. 6. Алгоритм обследования пациента на НСV-инфекцию

На рисунке 6 представлен алгоритм обследования пациента на НСV-инфекцию. Необходимо помнить, что у пациентов, инфицированных вирусом гепатита, С возможны несовпадения между результатами определения антител и РНК вируса.

Ложноотрицательные результаты в ИФА при положительной ПЦР имеет место в трёх ситуациях:
1. исследование произведено в ранние сроки после заражения, или в так называемую фазу «серологического окна», которое длится от 2 недель до 6 месяцев. Это является основной причиной того, что методами ИФА в сыворотке крови не всегда удается обнаруживать антитела против вируса гепатита С;
2. у иммуносупрессивных пациентов, в частности, у ВИЧ-инфицированных, онкологических и туберкулёзных больных;
3. при инфицировании редкими генотипами НСV-инфекции, например, 4 и 5 субтипами вируса С.

Негативная ПЦР при положительном ответе в ИФА чаще всего бывает вследствие низкой концентрации вируса в крови (порог аналитической чувствительности) или при действительной элиминации патогена из организма, но при этом антитела к вирусу гепатита С ещё могут циркулировать в крови до двух лет. В целом необходимо помнить, что серологическая диагностика НСV-инфекции, т.е. выявление специфических антител класса M и G, решает задачу этиологического диагноза ВГ, но не определяет характер и прогноз инфекционного процесса. Более того, тест-систем ИФА для практического здравоохранения с целью определения антигенов вируса гепатита С вообще не существует.

Таким образом, применение ПЦР позволяет выявлять вирус гепатита С на самом раннем этапе инфекционного процесса, поскольку РНК вируса гепатита С может обнаруживаться в сыворотке крови уже через неделю после инфицирования.
Ещё одной уникальной возможностью, которой обладает метод ПЦР, является определение генетической полиморфности вируса гепатита С. В настоящее время выделяют 6 основных генотипов вируса гепатита С, которые в свою очередь делятся на множество субтипов. В странах СНГ преобладающими являются 1, 2 и 3 генотипы ВГС, причем наличие субтипа 1b является наименее благоприятным признаком течения и успешной терапии НСV-инфекции. Метод ПЦР позволяет также определить перинатальное заражение ребёнка от НСV-инфицированной матери.

Таким образом, в диагностике, оценке прогноза и успеха противовирусной терапии НСV-инфекции метод ПЦР не имеет себе равных

ВИРУСНЫЙ ГЕПАТИТ D (НD V - от англ. Hepatitis D Virus

Вирус гепатита D является уникальным патогеном, занимающим промежуточное положение между вирусами и вириоидами, и классифицируется как рибозим. Вирус гепатита D был открыт в 1977 г. итальянским микробиологом Rizetto у больного хроническим вирусным гепатитом В. В начале его расценили как новый антиген НВV и обозначили согласно английскому алфавиту буквой “d” или HВdAg, т.е. вслед за HВcAg. Поcледующие исследования показали, что это самостоятельный вирус, а после открытия нового возбудителя гепатитов (НСV-инфекции) сложившуюся классификацию решили не менять. Вирус гепатита D является «дефектным», что обусловлено отсутствием собственной оболочки вокруг

Рис.7. Примерный серологический профиль, характерный для коинфекции вирусами D и В

вирусной РНК. Для этой цели вирус гепатита D использует НВsAg, посредством которого и происходит адгезия к мембране гепатоцита. Таким образом, НDV - это всегда микст-инфекция с HBV, которая может быть в форме коинфекции (одновременное заражение вирусами гепатита В и D) (рис. 7) или суперинфекции (на фоне хронической моно-HBV-инфекции происходит заражение НDV) (рис. 8). Поэтому эпидемиология, клиника, лечение, диагностика и профилактика HBV соответствует НDV. Лабораторное обследование на наличие вируса гепатита D обязательно всем пациентам только после обнаружения маркеров HBV-инфекции. Необходимо помнить, что серологический спектр маркеров HBV-инфекции зачастую обеднён, что обусловлено феноменом вирусной интерференции (ингибиция репликации вируса гепатита В вирусом гепатита D). При всех вариантах течения НDV – инфекции (ко- или супер-) метод ПЦР позволяет определить вирусную РНК в сыворотке крови пациента. Поэтому данный метод исследования может использоваться для контроля эффективности терапии и прогноза течения и исхода болезни. Клинически важно определить имеющуюся микст-инфекцию гепатитов В и D, так как это определяет прогноз течения и исхода вирусного гепатита. НDV усиливает некротический эффект при HBV, а, стало быть, повышает риск развития

Рис.8. Примерный серологический профиль, характерный для суперинфекции вирусом D с исходом в хронизацию фулминантной формы болезни или усиления цирротических процессов в печени у больного хроническим вирусным гепатитом В, снижает вероятность благоприятного ответа на противовирусную терапию.

ВИРУСНЫЙ ГЕПАТИТ G (НG V - от англ. Hepatitis G Virus)

Открытие вируса гепатита G (ВГG) в 1995 г. явилось следствием попыток ответить на вопрос, почему до 1/3 парентеральных ВГ оставались серологически недифференцированными. ВГG – это РНК-содержащий вирус из семейства Flaviviridae . В настоящеевремя доказано генетическое разнообразие вируса, имеющего 5 генотипов. Этот факт необходимо учитывать для правильной клинической трактовки результатов исследований. ВГG протекает чаще всего в иннапарантных или субклинических формах, что приближает его к НСV-инфекции. Хотя данный вирус выделен из крови и биоптатов печени больных хроническим гепатитом, что практически доказывает патогенность вируса, имеющиеся в настоящее время факты заставляют некоторых гепатологов критически отнестись к способности НGV-инфекции вызывать поражения печени. Это обусловлено рядом обстоятельств: так, вирус гепатита G чаще всего встречается в форме микст-инфекции с НСV; у 2% клинически здоровых доноров в сыворотке крови определяется РНК вируса гепатита G; до сих пор не уточнено место репликации вируса; не наблюдается корреляция между уровнем вирусемии и активностью АлАТ. Вместе с тем, не вызывает сомнения что выявление НGV-инфекции у пациента является важным фактором в клиническом понимании и оценке статуса больного с ВГ. По-видимому, НGV-инфекция является ко-инфекцией НСV и усугубляет течение последней.
В настоящее время серологические методы исследования (ИФА) по отношению к НGV ещё не доступны широкой клинической практике и поэтому метод ПЦР остается единственным способом доказать наличие инфицирования этим вирусом. Мы считаем обязательным обследование на НGV-инфекцию методом ПЦР:

• всех серонегативных больных острым или хроническим ВГ;
• пациентов с маркерами НСV-инфекции, особенно готовящихся к проведению противовирусной терапии;
• доноров крови;
• органы или ткани, предназначающиеся для трансплантации.

ГЕРПЕТИЧЕСКАЯ ИНФЕКЦИЯ

Современная таксономия семейства Herpesviridae огромна и включает в себя 80 видов вирусов, которые паразитируют в организме от устриц до человека. Герпес-вирусы имеют стабильные родовые свойства, основными из которых являются структура ДНК и механизмы инфицирования клеток хозяина. В настоящее время известно 8 патогенных для человека герпес-вирусов (табл.3). Герпес-вирусная инфекция является наиболее распространённой и может проявляться в разных формах: от пожизненной латентной персистенции до лимфопролиферативных состояний. В связи с этим любая герпесвирусная инфекция лучше всего характеризуется одним образным выражением: «однажды инфицирован – инфицирован на всю жизнь». Появляющиеся в ответ на внедрение вирусов герпеса специфические антитела зачастую не обеспечивают санацию организма от вирусов герпеса и не предупреждают рецидива заболевания. В связи с этим перед практикующим врачом стоят задачи: составить наиболее адекватный план лабораторного обследования и правильно оценить полученные результаты. Необходимо помнить, что антитела к большинству герпес-вирусов выявляются более чем у 90% людей старше 25 лет не имевших на момент обследования клиники каких-либо герпетических заболеваний. Вместе с тем, как указывалось выше, обнаружение в сыворотке крови ДНК какого-либо из герпес-вирусов не всегда означает дальнейшее развитие клинически манифестной инфекции или являться причиной имеющейся патологии. Поэтому врачу крайне важно провести дифференциальную диагностику между состоянием «инфицированности» и «болезни», вызванной каким-либо герпетическим вирусом .

Табл. Классификация герпес-вирусных инфекций человека

Альфа-герпесы Бета-герпесы Гамма-герпесы
ВПГ 1 - вирус
простого герпеса 1;
ВПГ 2 - вирус
простого герпеса 2;
V-Z - вирус ветряной оспы/
опоясывающего герпеса
ЦМВ – Цитомегаловирус;
ВГ-6 - Герпес-вирус 6 типа;
ВГ-7 - Герпес-вирус 7 типа
ВЭБ - Вирус Эпштейна-Барр;
ГВ-8 - Герпес-вирус 8 типа

С этой целью лабораторные исследования должны проводиться по алгоритму:

• 1 этап: тестирование на наличие противогерпетических антител класса М и G методом твердофазного ИФА, а также определение ДНК методом ПЦР (кровь, ликвор, секреты слизистой).
• 2 этап: не ранее чем через две, а лучше через три недели, повторить обследование методом ИФА на наличие вышеуказанных антител. Проведение ПЦР в этом периоде необходимо только в случае спорной клинической ситуации.
• 3 этап: обязательное обследование методом ПЦР для определения ДНК в сыворотке крови, ликворе или другой биологической среде, сроки которого определяются клинически и обычно зависят от протокола лечения. Серологические исследования на данном этапе носят второстепенный характер. Смысл такой последовательности заключается в том, что первых два этапа позволяют установить этиологию и характер инфекционного процесса (острая, хроническая или латентная формы). На третьем этапе, врач осуществляет прогноз инфекции, и если назначалось лечение, то оценивает его эффективность. В этой фазе лечебно-диагностического процесса метод ПЦР играет ключевую роль, т.к. уровень специфических антител не отражает степени виремии, а стало быть, прогноз болезни и качество проведенной терапии. Остановимся на лабораторной диагностике некоторых, наиболее значимых герпес-вирусов.

Вирус простого герпеса 1 и 2 типов (ВПГ 1+2)

Лабораторная диагностика заболеваний, вызываемых ВПГ 1+2 типов, включает в себя комплекс исследований, состоящий из выявления специфического иммунного ответа (антител), определения вирусной ДНК и вирусных белков (антигенов), а также подтверждение природы патогена культуральным методом (по цитопатогенному эффекту вируса в перевиваемой культуре клеток).

Серологические тесты на ВПГ, направленные на выявление антител против ВПГ 1+2, показали низкую диагностическую значимость из-за неоднозначности клинической трактовки. Это обусловлено тем, что у 97% - 100% обследованных клинически здоровых лиц обнаруживались указанные антитела. Нарастание титров антител к ВПГ происходит медленно в течение нескольких недель, при этом могут одновременно определяться специфические антитела класса М и G. Впоследствии антитела к ВПГ класса М могут циркулировать в крови в некоторых случаях от нескольких месяцев до нескольких лет. Этот феномен связывают с нарушением иммунитета у инфицированных ВПГ лиц. Кроме того, в случае реактивации ВПГ в крови могут вновь появиться специфические антитела класса М. С другой стороны, у иммуноскомпрометированных пациентов при рецидивах инфекции ВПГ антитела к вирусу (как IgM, так и IgG) могут не выявляться. Ложноотрицательный ответ на анти-ВПГ класса М может быть у новорождённых. Все выше перечисленное показывает на затруднительность дифференцировки острой инфекции ВПГ от её реактивации. Тем не менее, серологическое обследование необходимо проводить и делать это надо методом «парных» сывороток (с интервалом 14-21 день). Так, например, отсутствие в первой и появление во второй сыворотке противогерпетических IgM, или нарастание титров специфических IgG в 4 раза и более может быть показателем острой инфекции ВПГ. Таким образом, серологические тесты на наличие антител к ВПГ не могут служить единственным и надёжным критерием в постановке клинического диагноза.

Метод ПЦР в настоящее время является основным диагностическим способом в практическом здравоохранении для выявления ДНК вируса. При этом для выделения ДНК ВПГ может быть использован любой биологический материал: клетки, биологические жидкости, ткани и т.п. В настоящее время разработаны методы количественного определения вирусной ДНК в тестируемом образце. На основании полученных данных можно оценить форму инфекционного процесса. Так, если количество ДНК превышает 1000 копий геном-эквивалента (г/э) на 10 лейкоцитов периферической крови, это может свидетельствовать о развитии диссеминированной инфекции.

ЦИТОМЕГАЛОВИРУС (ЦМВ)

ЦМВ может быть причиной многих серьёзных заболеваний с летальным исходом. Темпы роста заражения ЦМВ составляют 1% в год, при этом к пятидесятилетнему возрасту инфицированность людей приближается к 100% показателю. Эти факты не позволяют однозначно ответить на вопрос о степени патогенности вируса. С одной стороны, ЦМВ редко вызывает клинически манифестные заболевания у иммунокомпетентных людей. С другой стороны, у иммунодефицитных пациентов отмечено развитие таких ЦМВ-обусловленных заболеваний, как мононуклеоз (гетерофильнонегативный вариант), хориоретинит, ретардация ментальных функций, глухота и т.п. Как и любая другая герпетическая инфекция при первичном инфицировании ЦМВ возникает пожизненная латенция. Реактивация ЦМВ-инфекции зависит от состояния иммунной системы организма, срыв которой приводит к возможности патологического влияния вируса на организм.


Лабораторная диагностика ЦМВ-инфекции включает в себя несколько подходов:

1. выявление инфекционных вирусных частиц или антигенов,
2. определение вирусной ДНК,
3. определение иммунного ответа организма,
4. выявление прямого цитопатического действия вируса, выделенного из в биологических субстратов пациента, на перевиваемую культуру клеток.

Серологические тесты на ЦМВ являются основными для установления инфицирования данным вирусом. Однако это отнюдь не является основанием для заключения о том, что болезнь действительно вызвана ЦМВ. Показано, что высокие титры анти-ЦМВ-антител обнаружены как у здоровых носителей, так и у больных с острым течением инфекции. Селективное определение специфических антител против ЦМВ класса М и G также не позволяет с полной уверенностью дифференцировать острую инфекцию, от реактивации хронической. Поэтому определение вирусных антигенов и ДНК ЦМВ становится важным тестом для диагностики заболевания этим вирусом.
Метод ПЦР широко используется для диагностики ЦМВ в любых биологических тканях и жидкостях, в том числе и биопсийном материале, фиксированном формалином. Этот метод превышает по своей чувствительности все имеющиеся аналоги. Для увеличения диагностической и прогностической значимости разрабатываются количественные методы исследования, создаются праймеры к сверхранним, ранним и поздним генам вируса. Кроме того, апробируются новые технологии ПЦР основанные на определении РНК-зависимой ДНК-полимеразы. Это позволит выявлять мРНК реплицирующегося ЦМВ. Во многих работах показано, что прямая детекция ДНК ЦМВ в плазме методом ПЦР коррелирует с повышенным риском развития манифестной формы ЦМВ или связанными с ней осложнениями. Кроме того, определение вирусной нагрузки ЦМВ в крови позволяет оценить эффективность противовирусной терапии.

ВИРУС ЭПШТЕЙНА-БАРР (ВЭБ)

Инфекция названная так в честь учёных Мишеля Эпштейна и Эвелины Барр, выделивших в 1964 г патоген из опухоли (лимфомы) Беркитта. ВЭБ широко распространённая инфекция, контаминация которой происходит обычно в молодом возрасте. При этом ВЭБ-инфекция, как и любая герпетическая инфекция, может протекать в форме первичного заражения или реактивации латентного процесса (табл. 4) . Как видно из представленной таблицы, ВЭБ - это потенциально онкогенная инфекция.

Таблица 4. Клинические варианты
ВЭБ-ассоциированных лимфопролиферативных заболеваний

Тип инфекции Заболевание
• Первичная инфекция
• Хроническая инфекция
• Реактивация хронической инфекции
• Инфекционный мононуклеоз
• Лимфома Беркитта
• Болезнь Ходжкина
• Синдром Дункана
• Назофарингиальная карцинома
• Лимфомы у ВИЧ-инфицированных

Лабораторная диагностика ВЭБ-инфекции базируется на цитологическом исследовании крови или костного мозга, серологических исследованиях (определение гетерофильных и противовирусных антител) и ПЦР. Алгоритм лабораторной диагностики представлен в таблице 5. Вирус ЭБ может быть обнаружен методом ПЦР в сыворотке крови, слюне, ткани опухоли и костном мозге. При этом важно сопоставление результатов клинических, серологических и молекулярных обследований в определении ВЭБ-инфекции, как причины имеющегося заболевания.

Таблица 5. Лабораторная диагностика и клиническая значимость маркеров ВЭБ-инфекции

Маркер
ВЭБ-инфекции
Время
возникновения
Клиническое значение
Гетерофильный тест С момента развития болезни до нескольких месяцев Острая стадия ИМ, отражает темпы реконвалесценции, дифференцирование между первичной и реактивацией хронической ВЕБ-инфекции
VСА - Ig М С момента развития болезни до двух месяцев Острая стадия ИМ
ЕА - Ig G С первой недели болезни до нескольких лет (в норме) Острая стадия ИМ, коррелирует с тяжестью болезни, при персистировании более двух-трёх лет указывает на хроническую форму ВЭБ-инфекции
ЕВNА -Ig G Через несколько недель после клинических проявлений с последующим пожизненным персистированием Стадия реконвалесценции, анамнестические антитела
ДНК в плазме До клинических проявлений болезни Репликация вируса в организме, показание к противовирусной терапии и критерии эффективности проведенного лечения

ПАПИЛЛОМАВИРУСНАЯ ИНФЕКЦИЯ ЧЕЛОВЕКА

Папилломавирусная инфекция человека (HPV– от англ. HumanPapillomaviruse)
HPV-инфекцию начали интенсивно изучать после установления доказательств роли данного вируса в возникновении опухолей аногенитальной области, в частности, рака шейки матки.

HPV - мелкие ДНК-вирусы, особенностью которых является пролиферативное влияние на эпителиоциты кожи и наружных слизистых. В настоящее время известно около 100 типов HPV, различаемых онкогенными свойствами. К группе высокого онкопотенциала относят следующие типы вирусов папилломы: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68. К типам с низкими предиктами онкогенности относят варианты: 6, 11, 42, 43 и 44. В таблице 6 представлены основные типы НРV и характерные для них клинические проявления. В лабораторной диагностике НРV–инфекции применяются исключительно молекулярно-генетические методы анализа. Использование метода ПЦР для выявления папилломатоза резко повышает уровень доклинической диагностики предраковых состояний, благодаря высочайшей чувствительности и предсказательной ценности типирования вируса. Проведенные эпидемиологические исследования в Европе и Северной Америке показали, что при всех формах инвазивного рака матки у 70% женщин старше 35 лет с дисплазией клеток эпителия матки был выявлен вирус папилломы, преимущественно 16 и 18 типов. У женщин с нормальной цитологией НРV обнаруживался только в 3,5% обследованных.

Типы HPV, обнаруженные при различных поражениях кожи и слизистых оболочек
(VilMers E.M., 1989)

Клинические проявления HPVтипы
Кожные поражения
Подошвенные бородавки 1, 2, 4
Обычные бородавки 2, 4, 26, 27, 29, 57
Плоские бородавки 3, 10, 28, 49
Бородавки Бютчера 7
Бородавчатая эпидермодисплазия 5, 8, 9, 10, 12, 15, 19, 36
Небородавчатые кожные поражения 37, 38
Поражения слизистых гениталий
Condylomata accurninata 6, 11, 42-44, 54
Некондиломатозные поражения 6, 11, 16, 18, 30, 31, 33, 34, 35, 39, 40, 42, 43, 51, 52, 55, 56, 57-59, 61, 64, 67-70
Карцинома 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 54, 56, 66, 68
Поражения слизистых оболочек не гениталий
Папилома гортани 6, 11, 30
Карцинома шеи, языка 2, 6, 11, 16, 18, 30

Таким образом, метод ПЦР в профилактике (доклинической диагностике) онкологических заболеваний аногенитальной области папилломатозной этиологии не имеет себе равных.

ХЛАМИДИОЗНАЯ ИНФЕКЦИЯ

Хламидии относятся к классу Rickettsias, и включает одно семейство Сhlamydiaceae с единственным родом Chlamydia. В настоящее время известны три видовых таксона: C. Trachomatis, C. Psittaci и C. Pneumoniae. Наибольший удельный вес имеют генитальные формы, которые вызываются C. Trachomatis. По данным специалистов ВОЗ ежегодно у около 50 млн. человек впервые диагностируется генитальный хламидиоз. Экологической нишей хламидийной инфекции является цилиндрический эпителий шейки матки, уретра и прямая кишка. Полагают, что около 10% всех женщин и мужчин инфицированы C. Trachomatis. При этом у ѕ пациентов хламидиоз протекает бессимптомно. Вместе с тем, хламидии могут вызывать тяжелые заболевания, характеризующиеся как хронические воспаления малого таза, приводящие к бесплодию (женскому и мужскому) и другим последствиям. Для диагностики хламидиозной инфекции используют прямые (культуральные и молекулярно-генетические) и косвенные (определение специфических антител) методы диагностики. Наиболее доступным и эффективным является метод ПЦР.

Число микроорганизмов в пробе

Относительный предел измерения (аналитическая чувствительность)
прямых методов диагностики C. trachomatis
(Carolyn M. Black, 1997).

МИКОПЛАЗМЕННАЯ ИНФЕКЦИЯ

Микоплазмы представляют собой мельчайшие бактерии, лишённые жесткой клеточной стенки. Последнее обстоятельство позволяет относить их, наряду с хламидиями, риккетсиями, актиномицетами и спирохетами к атипичным бактериям.
Патогенными для человека являются М. pneumoniae, вызывающая микоплазменную пневмонию, а так же M. Hominis и U. Urealyticum, вызывающие урогенитальные заболевания мужчин и женщин. Клинические проявления микоплазменной инфекции весьма разнообразны и зависят от вида возбудителя и состояния макроорганизма: от латентной инфекции до менингита новорожденных, артрита (синдром Рейтера) или бесплодия. Различают острый, подострый, вялотекущий и хронический микоплазмоз.
Лабораторная диагностика микоплазмозов без использования метода ПЦР сложна и обременительна. До внедрения молекулярно-диагностических способов диагностики лабораторная верификация любой формы микоплазменной инфекции строилась на малодоступном методе выделения чистой культуры и серологическом обследовании на наличие специфических антител. Это связано с тем, что до 80% здоровых людей имеют антитела к микоплазме и только нарастание титра антител в 4 раза является диагностически значимым. Основными преимуществами метода ПЦР в лабораторной диагностике микоплазмоза являются:

• высокая чувствительность, что особенно важно при хронических и подвергшихся лечению формах инфекции;
• высокая специфичность;
• менее строгие требования к забору и транспортировке материала;
• возможность быстрого получения результатов анализа .

ХЕЛИКОБАКТЕРНАЯ ИНФЕКЦИЯ

В 1983 г совершенно случайно из архивного эндоскопического биоптата микробиологами Marshall и Warren была выделена чистая культура Helicobacter pylori. Данный возбудитель - типичный антропоноз, экологической средой обитания которого является слизистая желудка, на которой H. Pylori может длительно (возможно, пожизненно) персистировать, не вызывая болезнь. Основными доказательствами этиопатогенетической значимости H. Pylori в возникновении и развитии язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки являются следующие факты:

• у больных с язвой двенадцатиперстной кишки и желудка статистически достоверно на 85-90% чаще выявляются маркеры хеликобактерной инфекции;
• у лиц, заражённых H. Pylori, язвенная болезнь развивается достоверно чаще, чем у лиц без данного патогена;
• эрадикация с помощью антибиотиков H. Pylori позволяет излечить язвенную болезнь.

Лабораторная диагностика хеликобактерной инфекции строится на следующих критериях:
1. Получение чистой культуры H. Pylori из эндоскопического материала и определение ее токсичности.
2. Микроскопия отпечатков биоптатов слизистой оболочки желудка и двенадцатиперстной кишки.
3. Определение уреазной активности в биопсийном материале или в содержимом желудка (респираторный тест).
4. Серологический тест на обнаружение антител к хеликобактеру.
5. Метод ПЦР для выявления ДНК в эндоскопическом биоптате.

ПЦР в этом ряду диагностических тестов имеет одно неоспоримое преимущество. Вследствие своей высокой чувствительности данный метод позволяет точно определить присутствие H. Pylori и ее способность к токсинообразованию (т.е.патогенность) и оценить эффективность проведенной терапии.

ТУБЕРКУЛЕЗ

Туберкулёз по-прежнему остается проблемой планетарного масштаба для современного общества. Это обусловлено целым рядом социально-экономических (бедность, недоступность медицинской помощи, предрассудки и т.п.) и медицинских (прежде всего эпидемией ВИЧ-инфекции) проблем. По данным ВОЗ от туберкулёза ежегодно умирает около 3 млн. человек.
Для лабораторной диагностики туберкулёза используется комплексный подход, который включает в себя специфические и неспецифические методы. Специфические методы лабораторной верификации туберкулёза состоят из четырёх этапов:

1. Бактериологический.
2. Молекулярно-генетический
3. Цитогистологический
4. Иммунологический.

Внедрение в практическую фтизиатрию молекулярно-генетических методов обследования стало решительным прорывом в диагностике различных форм туберкулёза (табл. 7). Применение ПЦР, как главного молекулярно-генетического метода исследования, позволяет в короткие сроки (до 48 часов) выявить микобактерии в любом биологическом материале. Это особенно важно, т.к. микобактерии отличаются замедленным ростом при культивировании на питательных средах. Так, аналитическая чувствительность коммерческих амплификационных тест-систем позволяет идентифицировать единичные колонии (до 10 клеток). Метод ПЦР позволяет избирательно проводить амплификацию фрагментов НК микобактерий, что позволяет добиться 100% специфичности и 97% чувствительности анализа.

Результаты анализа клинических образцов на наличие возбудителей туберкулеза микробиологическими методами и методом ПЦР

Результаты анализа Количество образцов Клинический диагноз
Посев Микроскопия ПЦР
N1/N2
Мокрота Моча Лаважная жидкость Кровь






4       Неспецифические заболевания легких








8 1 2   Различные формы туберкулеза у пациентов, получающих регулярное лечение в течение 3-6 мес
+
+
н
+
+
н
+
+
+
6/2
5


1

2 Инфильтративный либо диссименированный туберкулез в фазе распада; фиброзно-кавернозный туберкулез

н
н


н
+
+
+
12/1
3   1 9 Туберкулез внутригрудных лимфоузлов; первичный туберкулезный комплекс; туберкулезный плеврит

Примечание:
(+) - положительный результат анализа;
(-) - отрицательный результат анализа,
(н) - анализ не проводился,
N1-образцы с идентифицированной M.tuberculosis
N2-образцы с идентифицированной M.bovis.

Кроме того, необходимо подчеркнуть ещё два достоинства метода ПЦР. Во-первых, возможности определения внелегочных форм. Во-вторых, идентификация химиорезистентности микобактерий, что резко повышает эффективность терапии.
Таким образом, метод ПЦР позволяет на 30% повысить выявляемость микобактерий туберкулёза при значительном (в 10 раз) сокращении времени исследования.

ОНКОЛОГИЧЕСКИЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ

Онкологическая заболеваемость является одной из основных причин смертности, особенно среди населения стран СНГ, подвергшихся воздействию последствий Чернобыльской катастрофы и государств с высоким возрастным цензом населения. Концептуальное положение «опухоль – это патология генов» во многом определило стратегию диагностики и лечения новообразований. Определение понятий канцероген, протоонкоген и антионкоген, в сочетании с открытием и внедрением в клиническую практику метода ПЦР послужили решительным толчком в области диагностики и лечения новообразований (табл. 8). Тестирование молекулярно-генетических онкомаркеров предполагает выявление дефектов структуры и функциональную активность НК протоонкогенов, антионкогенов и биологических канцерогенов (вирусов). Наиболее приемлемым способом точно и быстро определять аномальных ДНК является ПЦР. Высокая чувствительность метода позволяет определять аномальную ДНК в ничтожно малых количествах (10-15-10-18 степени), что означает выявление неопластических клеток на доклинической стадии опухолевого процесса.
Основные направления использования ПЦР в онкологической патологии включают:

1. ДНК-диагностику наследственных форм рака.
2. ДНК-диагностику спорадических форм рака.
3. Определение микрометастазов.
4. ДНК-диагностику биологических канцерогенов (HPV 16 и 18 типов, ВЭБ-инфекции, HBV и HCV, ретровирусы и т.п.).
5. Доклиническую диагностику опухолей (определения протоонкогенов и антионкогенов).
6. Прогноз заболевания и успешности назначаемой терапии, а также эффективность проведенного лечения на основе диагностики функциональной активности онкогенов.
7. Исследование «архивных» биоптатов с установленным клинико-гистологическим диагнозом. Это важно в оценке диагностической значимости предполагаемого маркера и правильности терапии.

Опухоли и прогностические ДНК-маркеры или их РНК продукты

Вид опухоли ДНК-маркеры неблагоприятного прогноза ДНК-маркеры благоприятного прогноза
Рак молочной
железы
RHAMM, CCNDI, ST3Gal I иST3Gal III, НОГ, MDRI, HER2, ERBB2 ген стероидной сульфатазы, кадгерина-11
Рак предстательной эктопическая экспрессия в тестикулах гена TSPY, гиперэкспрессия орнитинкарбоксилазы, отсутствие экспрессии трансформирующего фактора роста (Tgf-І)  
Немелкоклеточный рак легкого гиперэкспрессия циклин-зависимых киназ Cdc25A и Cdc 25B, снижение экспрессии ингибитора клеточного цикла p27 KIPI, аллельная потеря антионкогена FHIT экспрессия гена TSP2
Колоректальные опухоли повышенная экспрессия катепсина D, CD44, р53, и тимидилатсинтетазы, экспрессия генов MRP 1 и рецептора витамина D, отсутствие экспрессии р21 и потеря гетерозиготности по маркерам длинного плеча хромосомы 18  
Карциномы пищевода и желудка гиперэкспрессия генов ST3?BM-40/SPARK, МЕТ., потеря гетерозиготности по маркерам длинного плеча хромосомы 18  
Рак поджелудочной железы гиперэкспрессия генов транскрипционного фактора Id2, каспазы- 1, тимидинфосфорилазы, потеря гетерозиготности по короткому плечу хромосомы 1  
Глиомы экспрессия гена опухолеассоциированного антигена Gage и гомозиготные делеции длинного плеча хромосомы 10, включая ген-супрессор PTEN  
Карцинома печени гиперэкспрессия генов циклина А  
Саркома мягких тканей конечностей гиперэкспрессия генов циклина А  
Карцинома почки экспрессия гена кадгерина-6  

Примечания: CCNDI - ген циклина, ERBB2 - ген эстрогеновых рецепторов, НGF - ген фактора роста гепатоцитов, ST3GalIи ST3Gal - гены сиалотрансферазы, MDR1 - ген лекарственной резистентности, ICAM-1 - ген интегринового рецептора, PSA - ген простато-специфического антигена, NM2 - антиметастатический ген, TGF-І - ген трансформирующего фактора роста, TSP2 - ген тромбоспондина.
Использование метода ПЦР в практической онкологии даст ценную научную и клиническую информацию врачу, что значительно улучшит качество диагностики и лечения этой патологии

НАСЛЕДСТВЕННЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ И ПРЕНАТАЛЬНАЯ ДИАГНОСТИКА

В патогенезе наследственных болезней лежат аномалии наследственного аппарата (генома) клетки. Данные повреждения могут затрагивать весь геном или только отдельные хромосомы клетки. В связи с этим могут возникать хромосомные или генные болезни. По данным генетического мониторинга в странах Восточной Европы нарушения генома разной степени встречаются у 1,5 – 2% всех новорожденных, что влияет на показатели здоровья детского населения. Методы молекулярной диагностики в своей сути явились продуктом исследований в области устройства генома клетки человека. Согласно прогнозам специалистов Международной научной программы «Геном человека» полная расшифровка первичной структуры генома человека состоится к 2006-2010 гг.

В настоящее время ПЦР является основным диагностическим средством в клинической практике генетика (рис.9). С помощью ПЦР можно определять локализацию предполагаемых мутаций или полиморфных сайтов в ДНК клетки. Подбор системы праймеров производят на основании анализа нуклеотидной последовательности исследуемого участка ДНК. Разработаны и практически применяются варианты автоматического поиска последовательностей ДНК, использование которых оптимизирует амплификацию необходимого участка ДНК. В качестве источника матричной ДНК, что особенно важно, может использоваться любой биологический материал (даже деструктурированный!), сохранивший в своем составе определённую часть нуклеотидной последовательности. Существует множество модификаций ПЦР для медико-генетического анализа, применение которых зависит от целей и характера исследований. Самым главным достоинством ПЦР для медико-генетической диагностики является универсальность, позволяющая проводить исследования на любой стадии онтогенеза индивидуума, в том числе и в пренатальном периоде. В диагностике генетических болезней имеют место два подхода:

• прямая диагностика, основанная на непосредственной идентификации мутации в определённом гене;
• косвенная (непрямая) диагностика, основанная на маркировании мутантного гена с помощью молекулярных маркеров.

Прямая диагностика основана на определении мутации в самом гене. Этим создается высокая точность исследования (98-100%) и возможность пренатальной диагностики в семье и выявления гетерозиготных носителей при отсутствии больного ребёнка.

Принципиальная схема пренатальной диагностики наследственных болезней.
Институт акушерства и гинекологии им. Д.О.Отта РАМН


Непрямой или косвенный подход является более универсальным и распространённым. Его суть лежит в анализе внутри- и внегенных полиморфных сайтов. Главное достоинство косвенного метода – возможность ДНК-диагностики без точной идентификации мутации в самом гене даже при отсутствии данных о точной идентификации мутантного гена. Недостатком этого метода является необходимость наличия в семье больного ребёнка или возможность исследования «архивной» ДНК в случае его гибели. Кроме того, имеется более высокий процент ошибки, обусловленный переносом полиморфного сайта на здоровый аллель вследствие кроссинговера.
Общая ошибка для обоих методов пренатальной ДНК-диагностики заключается в риске контаминации плодного образца материнскими клетками.

В настоящее время можно осуществлять пренатальную клиническую диагностику методом ПЦР следующих моногенных заболеваний: гемофилия А и В, миодистрофия Дюшена/Беккера, болезни Хантера и Леш-Нихана, агаммаглобулинемию, муковисцидоз, фенилкетонурию, синдромы Альпорта и Шарко-Мари-Тус, болезнь Коновалова-Вильсона и дефицит альфа-1-антитрепсина и т.п.

СУДЕБНО-МЕДИЦИНСКАЯ ПРАКТИКА

За последние несколько лет для установления отцовства и проведения опознания трупов метод ПЦР стал основным методом экспертной оценки. Для исследований могут использоваться высушенные пятна крови, обрывки или кусочки органической ткани (например, костной), смывы из носоглотки, соскобы из слизистой урогениталий, и, что самое удивительное, фиксированные гистологические препараты. Генетические отличия/совпадения определяют, исследуя высокополиморфные участки молекул НК, в частности, участки с варьирующим числом коротких повторов (variable number of tandem repeats, VNTR). Анализ аллельных вариантов нескольких полиморфных VNTR-локусов позволяет проследить родственные связи индивидуума или установить причастность того или иного лица к преступлению. В настоящее время в криминалистике и судебной медицине метод ПЦР используется в следующих целях:

• для определения отцовства;
• идентификации личности неопознанных трупов;
• доказательства причастности какого либо лица к совершению преступления.

ТРАНСПЛАНТАЛОГИЯ

Современная трансплантационная хирургия невозможна без использования метода ПЦР, который гарантированно показывает степень тождественности гомотрансплантатов. При этом важно помнить, что, используя ПЦР для сопоставления генетической совместимости донора и реципиента результаты исследования можно получить в максимально короткое время. В настоящее время тождественность между донором и реципиентом определяют по антигенам главного комплекса гистосовместимости (HLA) класса I и II, ответственным за реакцию отторжения. При этом если для типирования HLA класса I используется достаточно доступный лимфоцитотоксический тест (метод Тарасаки), то для анализа HLA класса II (гены DQ, DR и DP), до разработки метода ПЦР, было весьма затруднительным. По признанию специалистов в области трансплантации успех операции пересадки органа или костного мозга в настоящее время определяется, прежде всего, максимально точно подобранной парой донор-реципиент. В связи с этим все отделения трансплантации (хирургические или онкогематологические) в обязательном порядке имеют в своем составе ПЦР-лабораторию. В настоящее время имеются достаточное количество зарубежных и отечественных амплификационных тест-систем определяющих антигены гистосовместимости.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Методы молекулярно-генетического анализа, к которым относится и ПЦР быстро развивающаяся биотехнологическая отрасль науки и техники. В настоящее время на метод ПЦР только в Северной Америке ежегодно тратится около 200 млн. долларов. Рост спроса во всем мире на данный метод диагностики неуклонно растет и в денежном эквиваленте прогнозируется на сумму 1400.0 млн долларов к 2005 году. Бурно развиваются молекулярно-генетические методы в диагностике генетических и инфекционных заболеваний, доклинической диагностике степени риска новообразований. Очень перспективным направлением является использование ПЦР для определения патогенов в пищевых продуктах и абиотических средах (предметы обихода, жилище, одежда и т.п.).
Мы надеемся, что данное методическое руководство дает достаточно полную информацию о возможностях метода полимеразной цепной реакции, его достоинствах и недостатках.