- Тромбоцитопенія: діагностична тактика.
- Оцінка печінкових проб.
- Анемії: стратегія і тактика діагностичного пошуку.
- Лабораторна діагностика інфекції,що викликана вірусом Епштайна-Барра.
Лабораторна діагностика інфекції,що викликана вірусом Епштайна-Барра.
Заблоцкая С.Г., Шевченко Н.М., Ольховский И.А.
Вирус Эпштейн-Барра (ВЭБ) был впервые описан в 1964 году Epstein,
Achong и Barr при электронной микроскопии культуры лимфобластов
полученных у больного лимфомой Беркитта. На основе морфологических
признаков данный вирус был классифицирован как герпес вирус 4
типа. Этот вирус относится к подсемейству Gammaherpesvirinae
рода Gymphocryptovirus.
ВЭБ поражает в основном два типа клеток: эпителий верхних дыхательных
путей и пищеварительного тракта, а также В-лимфоциты, которые
в результате инфицирования иммортализуются. Соответственно, ВЭБ
вызывает
такие различные заболевания, как инфекционный мононуклеоз или
злокачественная лимфома Беркитта, злокачественная носоглоточная
карцинома.
Заболевания, обусловленные ВЭБ, относятся также к СПИД- индикаторным патологиям. Показана этиологическая роль ВЭБ при волосатой лейкоплакии - характерного для СПИДа поражения слизистой оболочки рта. Имеются данные о роли ВЭБ в возникновении энцефалопатии при ВИЧ-инфекции. Обсуждается роль ВЭБ, как лимфопролиферативного вируса, в активации специфических В-лимфоцитов, приводящей к прогрессированию ВИЧ-инфекции, развитию неходжкинской лимфомы и синдрома лимфоаденопатии.
Источником вируса является больной человек или носитель, вирус выделяется со слюной в продромальном периоде, в разгаре заболевания и рековалесценции в срок до 6 месяцев. Вирус во внешней среде стоек, поэтому заражение может осуществляться воздушно-капельным и контактно-бытовыми путями. Показана возможность трансфузионной передачи ВЭБ от доноров с острой фазой первичной инфекции. Предполагается также трансмиссивный путь передачи вируса на основе территориального совпадения «лимфоидного пояса» (эндемичные районы по распространенности лимфомы Беркитта) с зоной распространения некоторых комаров и москитов рода Anophelesu Monsonia. Заболевание малоконтагиозно за счет наличия большого числа иммунокомпетентных лиц.
Инфекция, вызываемая ВЭБ, характеризуется разнообразием клинических проявлений. Инфицирование обычно происходит в детстве или подростковом возрасте. В большинстве случаев первичная инфекция у детей протекает субклинически. Распространенность инфекции, вызываемой ВЭБ, чрезвычайно широка. В развивающихся странах практически все детское население к возрасту 3 лет уже инфицировано. Эпидемиологические исследования в США показали, что у детей до 5 лет инфицированость составляет 50%, а у взрослых 80%. Инфекция передается преимущественно через слюну, но описаны случаи трансфузионного заражения.
В юношеском возрасте инфекция ВЭБ может протекать
в форме инфекционного мононуклеоза, характерными клиническими проявлениями
которого являются боль в горле, лихорадка, спленомегалия, гепатомегалия
и аденопатия. Студенты и военнослужащие являются группами повышенного
риска развития инфекционного мононуклеоза.
После первичного заражения ДНК ВЭБ может встраиваться в геном В-лимфоцитов
и реплицироваться вместе с ДНК клетки-хозяина, что является причиной
латентной инфекции, которая может сопровождать человека на протяжении
всей его жизни. Транзиторные иммунодефицитные состояния, характерные
для больных, перенесших операции по трансплантации органов, больных
злокачественными новообразованиями, беременных женщин и лиц преклонного
возраста могут приводить к реактивации латентной инфекции. Персистирование
ВЭБ является этиологическим фактором клинического синдрома, получившего
название «хроническая ВЭБ инфекция» или «хронический мононуклеоз».
В юношеском возрасте инфекция ВЭБ может протекать
в форме инфекционного мононуклеоза, характерными клиническими проявлениями
которого являются боль в горле, лихорадка, спленомегалия, гепатомегалия
и аденопатия. Студенты и военнослужащие являются группами повышенного
риска развития инфекционного мононуклеоза.
После первичного заражения ДНК ВЭБ может встраиваться в геном В-лимфоцитов
и реплицироваться вместе с ДНК клетки-хозяина, что является причиной
латентной инфекции, которая может сопровождать человека на протяжении
всей его жизни. Транзиторные иммунодефицитные состояния, характерные
для больных, перенесших операции по трансплантации органов, больных
злокачественными новообразованиями, беременных женщин и лиц преклонного
возраста могут приводить к реактивации латентной инфекции. Персистирование
ВЭБ является этиологическим фактором клинического синдрома, получившего
название «хроническая ВЭБ инфекция» или «хронический мононуклеоз».
В-лимфоциты, морфологически идентичные таковым у больных инфекционным мононуклеозом, описаны недавно у больных СПИД. Это может быть связано с реактивацией предшествующей ВЭБ инфекции на фоне приобретенного иммунодефицита
В лабораторной диагностике используют серологические методы и методы выявления вирусных антигенов и вирусной ДНК. Вирусный нуклеокапсид выявляют в смывах из носоглотки в реакции иммунофлюорисценции с использованием специфических к ВЭБ антител. Более чувствительным и специфичным является метод детекции ДНК ВЭБ в полимеразной цепной реакции (ПЦР), позволяющей поставить или подтвердить диагноз острой инфекции при выявлении ДНК ВЭБ в слюне и/или крови
Из серологических методов исследования используются различные модификации гетерогемагглютинации для выявления гетерофильных антител. Наиболее распространенной является реакция Пауля-Буннеля, в которой выявляются антитела к эритроцитам барана. (диагностический титр 1:32).
Однако такие антитела могут выявляться и при других заболеваниях (ОРЗ, вирусные гепатиты и др.), что обусловлено наличием в эритроцитах барана F-антигена (антиген Форсмана). Поэтому более специфична реакция Пауля-Буннеля-Давидсона, где сыворотку предварительно истощают субстратом, имеющим F-антиген (например, экстракт почки морской свинки), или реакция Хоффа-Бауэра на лошадинных эритроцитах, не имеющих F-антиген (диагностический титр 1:14 - 1:28). Одна из модификации - реакция Ловрика, проводящаяся на стекле с эритроцитами барана, обработанными и необработанными протеолитическим ферментом папаином. Реакция считается положительной при наличии агглютинации на нативных эритроцитах и при отсутствии таковой на гидролизированных эритроцитах. Основные недостатки методов агглютинации заключаются в их трудоемкости (необходимы свежие эритроциты), недостаточно высокой специфичности и чувствительности, особенно для детей младше 4 лет, для которых ложноотрицательные результаты могут быть получены более, чем в 25% случаях.
Непрямой иммунофлуоресцентный анализ связывания специфических антител с вирусом, культивированным в лимфобластоидных клетках, до сих пор считается «золотым стандартом» серодиагностики ВЭБ - инфекции, однако он не поддается автоматизации и его трудно стандартизировать вследствие вариабельности антиген - продуцирующих клеток и субъективности оценки результатов. В связи с этим в настоящее время все шире в серологической диагностике используется ИФА.
В процессе репликации вируса экспрессируется свыше 70 различных вирусоспецифических белков, однако, к настоящему времени выделены группы наиболее иммуногенных белков, определение антител к которым дает возможность дифференцировать стадию инфекции.
EA (Early Antigen) - ранний антиген, включает белки
р54, р138, соответственно диффузный (EA-D) и рестриктрирующий (EA-R)
компоненты.
EBNA-1 (Epstein-Barr Nuclear Antigen - ядерный антиген, белок р72
VCA (Viral Capsid Antigen) - капсидный антиген, включает комплекс
белков р150, р18, р23; к настоящему времени показано, что иммунодоминантными
белками в этом комплексе являются р18 и р23.
MA (Membrane Antigen) - мембранный белок, gh125 (BAKF4).
Наиболее специфичными и чувствительными маркерами
острой инфекции являются Ig G к раннему антигену (ЕА) и Ig M к капсидному
комплексу (VCA), и паст-инфекции - Ig G к EBNA-1.
Инфицирование клеток-мишеней может вести как к латентному, так и
инфекционному циклу развития вируса. В обоих случаях одним из ранних
экспрессируемых вирусных агентов является мембранный антиген, распознаваемый
Т-лимфоцитами. Установлено, что у большинства пациентов инфицирование
ВЭБ приводит к синтезу гетерофильных антител. Экспрессия EBNA-1 антигена
происходит через 12-24 часа после заражения, одновременно или после
экспрессии мембранного антигена вируса. Показано, что EBNA-1 является
неструктурным внутриклеточным антигеном и присутствует во всех трансформированных
клеточных линиях, полученных у больных лимфомой Беркитта и назофарингиальной
карциномой. В цикле репликации вируса капсидный антиген появляется
позже EBNA-1.
Последние исследования указывают на то, что, возможно EBNA-1 является не единичным антигеном, а полиантигеным комплексом. Основной компонент EBNA-1 был очищен и секвенстирован.
Определение антител класса Ig G к EBNA-1 может быть использовано для диагностики острой рековалесцентной стадии инфекционного мононуклеоза. Они редко присутствуют в острой фазе заболевания и их уровень повышается во время выздоровления. Антитела обычно присутствуют в максимальной концентрации в период между 3 месяцами и 1 годом с начала заболевания и персистируют в течении всей жизни.
Ранний антигенный комплекс представляет собой результат ранней транскрипции, предшествующей синтезу ДНК. Матричная РНК, синтезирующаяся в результате транскрипции, кодирует ферменты, необходимые для синтеза вирусной ДНК и дальнейшего образования новых вирусных частиц. Антитела класса IgG к раннему антигену обычно встречаются у больных на ранней стадии инфекции, хотя могут выявляться и на поздних стадиях этого заболевания. Высокий уровень IgG к раннему антигену характерен для больных назофарингиальной карциномой.
Дополнительным подтверждением течения острых стадий инфекции может служить тест по выявлению ДНК ВЭБ в крови и/или слюне методом ПЦР. Этот тест весьма эффективен для выявления ВЭБ - инфекции у новорожденных, когда выявление серологических маркеров малоэффективно вследствие несформировавшейся иммунной системы, а также в сложных и сомнительных случаях.
Таким образом, определение IgG к антигенам EBNA и ЕА, а также IgM к VCA дает необходимую и достаточную информацию для постановки диагноза и установления стадии инфекции.
Таблица 1. Иммунный ответ на разных клинических стадиях инфекционного мононуклеоза
Маркер | Острая фаза | Острая фаза | Рековалесцентная фаза |
VCA-Ig G | нарастают | персистируют на невысоком уровне | персистируют пожизненно на невысоком уровне |
VCA-Ig M | присутствуют | снижаются | нет или очень мало |
EBNA-1 Ig G | нет или очень мало | начинают нарастать | персистируют пожизненно на невысоком уровне |
EA-D | начинают нарастать | персистируют на невысоком уровне | персистируют пожизненно на невысоком уровне |
гетерофильные антитела | присутствуют | снижаются | нет или очень мало |
Таблица 2. Интерпретация серологических данных
VCA-Ig M | EA-IG G | EBNA-IG G |
||
1 | Инкубационный период или отсутствие инфицирования | - | - | - |
2 | Очень ранняя первичная инфекция | + | - | - |
3 | Ранняя первичная инфекция | + | + | - |
4 | Поздняя первичная инфекция | +/- | + | +/- (ОП < 0,5) |
5 | Атипичная первичная инфекция | + | - | _ (ОП < 0,5) |
6 | Хроническая инфекция | -/+ | + | - |
7 | Ранняя паст-инфекция | - | + | + |
8 | Поздняя паст-инфекция | - | _ | + |
9 | Реактивация | + | + | + (ОП>0,5) |
10 | Атипичная реактивация | + | - | + (ОП>0,5) |